请教-流动相PH的选择_化学药分析_药物分析_仪器论坛

主题:【悬赏帖】请教-流动相PH的选择

浏览 |回复9 电梯直达
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    ①: 请问,液相使用流动相为磷酸盐缓冲液,测定的样品为血液制品人血白蛋白或人免疫球蛋白,那么流动相的调节应该怎么进行。
    ②: 经测定,使用的磷酸盐缓冲液PH为5.25,测定结果的拖尾因子为0.94,要想控制在0.95-1.40范围内的话该调高还是调低?
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m3169744
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maii
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以上总体是一个问题。与化合物的pka值有关,先去查pka值,一般流动相的PH值与pka值差2以上。采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时,通过调节流动相的pH值,以抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸,流动相的pH值越小,组分的k值越大,当pH值远远小于弱酸的pKa值时,弱酸主要以分子形式存在;对弱碱,情况相反。分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
m3169744
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根据你的描述,推测使用方法很可能是SEC.那么SEC一般建议的磷酸盐缓冲体系pH可以在7.0附近,针对HSA和IgG也是非常合适的,你可以将pH调整至7.0试一下,拖尾因子会有所改善。此外,除了pH之外,你也可以使用以下方法改善拖尾:
1.使用NaCl增加磷酸盐的盐粒子浓度(150mM即可,不要高于200mM)。
2.流动相中加入适量Arg(精氨酸)。
3.流动相中加入不高于5%的乙腈或者异丙醇。
4.适当提高分析过程的柱温。
夏天的雪
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依据您已有测定结果,可能需要往酸性调节,但是会有一个合适的pka范围,ph太大或太小都可能影响出峰,可以进行尝试性优化,建议先往酸性微调,另外,用的是等度条件还是梯度条件,流动相是什么,条件允许,可以适当改变有机相浓度,出峰提前一些可能对对称因子也会有帮助,还有,色谱柱的使用状况如何,如果柱效降低,也会影响拖尾因子,个人意见,供参考。
Insm_cad297e3
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原文由 m3169744(m3169744) 发表:请问你使用的方法是SEC还是CEX?
弱弱的问一句。sec和cex是什么?刚入门,不懂。??
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原文由 夏天的雪(bingwang228) 发表:依据您已有测定结果,可能需要往酸性调节,但是会有一个合适的pka范围,ph太大或太小都可能影响出峰,可以进行尝试性优化,建议先往酸性微调,另外,用的是等度条件还是梯度条件,流动相是什么,条件允许,可以适当改变有机相浓度,出峰提前一些可能对对称因子也会有帮助,还有,色谱柱的使用状况如何,如果柱效降低,也会影响拖尾因子,个人意见,供参考。
梯度洗脱,流动相为waters的醋酸盐浓缩液,配制方法为取200ml加入2000ml的水。调酸的话是用50%的磷酸来调吗?那调碱用什么?
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原文由 maii(maii) 发表:以上总体是一个问题。与化合物的pka值有关,先去查pka值,一般流动相的PH值与pka值差2以上。采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时,通过调节流动相的pH值,以抑制样品组分的解离,增加组分在固定相上的保留,并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸,流动相的pH值越小,组分的k值越大,当pH值远远小于弱酸的pKa值时,弱酸主要以分子形式存在;对弱碱,情况相反。分析弱酸样品时,通常在流动相中加入少量弱酸,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时,通常在流动相中加入少量弱碱,常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
不知道血液制品怎么查PKA,。T?T
m3169744
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原文由 Insm_cad297e3(Insm_cad297e3) 发表:弱弱的问一句。sec和cex是什么?刚入门,不懂。??
SEC体积排阻色谱,CEX阳离子交换色谱
m3169744
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原文由 m3169744(m3169744) 发表:SEC体积排阻色谱,CEX阳离子交换色谱
这是生物大分子经常用的检测手段