主题:【第十届原创】 第十届原创大赛有奖征文--换个角度结果就不同---记一个杂质分离方法开发过程

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g15160563
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      毕业到现在也有些年头了,很荣幸刚毕业就接触液相,并一直从事液相相关的工作,各种类型,各种难题,应该说差不多都算见过。现在回想一下,一路走来都是一点点积累,一点点成长。以下给大家分享的是一个我自己认为比较经典的案例,有时候换个角度,换种思路,结果就不一样了。

      首先来看看需要分离的三个物质的结构式:
               
    1.分析目的要求
    开发一种合适的分析方法,使上述3种化合物在浓度1.0mg/ml的情况下分离度大于1.50;
    开始方法开发之前,第一件该做的事是什么呢?
    当然是去了解这几个物质的性质,尽可能的得到有关这些物质的信息,这样可以为后面工作节省最多的时间。而对这三个物质得到的信息大致如下:三种物质极性比较强,水溶性比较好,在常规C18色谱柱保留太弱,基本上与溶剂峰重叠。结构式上主要是官能团的差异,分别为-NH2,-Br,-COOH,差异性很大。综合考虑,有俩种方案:一是加离子对试剂,用反相C18色谱柱增强保留,进行分离;二是使用离子交换色谱柱进行分离。首先由于个人的习惯,离子交换色谱被我直接排除(离子色谱平衡比较慢,而且离子交换色谱柱非常容易出现重现性问题)。所以本实验采用C18添加离子对试剂的方法。
    考虑的实验过程中需要使用离子对试剂,且流动相pH需要大范围调整(可能用到碱性流动相),所以色谱柱选择月旭Xtimate C18(4.6×250mm,5μm)色谱柱,流速:1.0ml/min,柱温30℃,检测波长220nm。
    2.流动相优化及测试结果图谱
    2.1  初步尝试流动相:0.05mol/L庚烷磺酸钠+0.05mol/L磷酸二氢钾,PH=4.60
          结果:化合物3保留时间2.6min,化合物1不出峰。估计是化合物1保留太强未洗脱下来。接下来,调整pH并增加有机相的比例,来加大洗脱能力;
  2.2  流动相:缓冲液(1.00g辛烷磺酸钠,10mM磷酸二氢钾至500ml水中,用磷酸调PH=2.30):甲醇=60:40
        混合对照图谱如下:
                     
      实验中将庚烷磺酸钠改为辛烷磺酸钠,增加有机相(甲醇)比例,结果三个物质分离良好,但是化合物1(19.9分钟)峰型太差,下一步优化化合物1的峰型。
      2.3  流动相:缓冲液(1.00g辛烷磺酸钠,10mM磷酸二氢钾至500ml水中,用磷酸调PH=2.30):乙腈=80:20
            化合物1图谱:
                   
          基于上一次实验,将有机相甲醇变为乙腈,通过改变选择性看是否峰型会有改善。结果发现并没有任何改善,而且发现这个方法中有机相只提供洗脱能力,不提供选择性改变作用。
        2.4  流动相:缓冲液(缓冲液:1.00g十二烷基磺酸钠,50mM氯化铵至500ml水,用磷酸调PH=1.80):甲醇=60:40
          混合对照图谱:
                   
      当时换成这个流动相的主要思路是,加十二烷基磺酸钠使保留更强,加氯化铵提高离子浓度,调PH至1.80强酸性使化合物1中-NH2官能团作用更弱,达到优化峰型的目的,但是效果很差。回头总结发现我们所有的目光都聚焦在三种物质的不同官能团上,导致越走越偏离分离的轨迹,这里,三个物质共同含有的官能团可能也是影响分离的主要因素,换了个角度后,豁然开朗了。推翻了之前的方案,将离子对试剂换为四丁基氢氧化铵,从头开始。
    2.5  流动相:缓冲液(4ml 10%四丁基氢氧化铵水溶液,1.36g磷酸二氢钾至500ml水中,用三乙胺调PH=9.30):乙腈=80:20

        混合对照图谱:
                 
        流动相中添加三乙胺和并将PH调成9.3目的是抑制化合物1的拖尾,但是结果发现三种物质没有分开。继续优化条件将PH值降低。
        2.6  流动相:缓冲液(4ml 10%四丁基氢氧化铵水溶液,1.36g磷酸二氢钾至500ml水中,用三乙胺调PH=7.00):乙腈=80:20

        混合对照图谱:
                   
        看到这结果是不是项目就OK了。但是既然是方法开发,方法重现性实验实验是必不可少的,需要用一根新色谱柱重现该色谱条件。
        结果问题就来了。 化合物1图谱:
                   
      化合物1峰型一直分叉,最终发现应该是色谱柱使用多种离子对试剂,造成色谱柱改性,新色谱柱不能重现结果。好吧,再开始。
      然后又是继续摸索。不得不说有时候运气也是成功的一部分,在一次流动相配置过程中,看到四丁基氢氧化铵试剂旁边还有一瓶四丁基溴化铵,突然我就冒出想法,用四丁基溴化铵试试,不知道结果会怎么样,说做就做。
      2.7  流动相:缓冲液(1.00g四丁基溴化铵,1.36g磷酸二氢钾,1.0ml三乙胺至500ml高纯水。用磷酸调节PH=7.10):乙腈=80:20
    混合对照图谱:
                 
      结果:分离度,峰型都满足要求,完美。当然还是需要重现方法的。
      三根新色谱柱重现结果:
                       
      最终色谱条件:
      色谱柱:月旭Xtimate  C18(4.6*250mm,5μm)
      流动相:缓冲液(1.00g四丁基溴化铵,1.36g磷酸二氢钾,1.0ml三乙胺至500ml高纯水。用磷酸调节PH=7.10):乙腈=80:20
      检测波长:220nm;柱温:30℃;流速:1ml/min;进样体积:10μl
      搞定交差!!!!
    3、总结

    在液相应用方法开发过程中,首先需结合需要分离的目的,确定思路,一个方法最初的思路,是决定这个方法开发的效果,效率的最根本因素;其次是细节,任何细节都有可能导致你实验的成功与否;最后是运气,牛顿发现万有引力还有运气成分呢,说不定你是下一个。
  同时,在一个方法确定好之后,一定需要使用一根新的色谱柱来验证,因为在方法开发过程中,我们会使用到各种流动相条件,会对色谱柱一个改性,特别是使用离子对试剂的方法,否则后续的重现性问题会是一个非常头痛的事情。
初心
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月旭科技--小S
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感谢楼主的宝贵经验分享!方法开发真是需要智商非常高,并且热爱钻研的人,又不怕挫败,佩服!感谢像楼主这样的人,为国家的色谱事业发展,所做出的贡献!
月旭科技-雪妖
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这种差异物质相对来说差异比较小,LZ费了很多心思。
氢锂钠钾铷铯钫
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值得学习了,新颖!
通过作者文章,感觉作者是读了几本书的。
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2017/9/25 21:17:28 Last edit by YJYQXCYS
hanyxin
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从作者提供的图谱来看,前两个峰的保留还是稍微弱了一点,第3个峰的保留稍强。
可以考虑采用梯度洗脱
zyl3367898
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为何换成四丁胺氢氧化铵?理由是什么?
wsy18
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氢锂钠钾铷铯钫
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wsy18
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原文由 月旭科技-雪妖(czj_1027) 发表:
很好的思路,楼主的经验相当丰富呢
思路很开阔。