主题:【第十届原创】2017饮料中着色剂草根比对实验记录(续)

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            七月初参加了仪器信息网举办的饮料中柠檬黄日落黄的草根比对,8月初我们收到了举办方反馈回来的结果,如下
                 
      我们柠檬黄结果偏离了指定值很多。柠檬黄的结果为什么会出现这么大的偏离,是实验过程存在问题,还是数据处理问题? 我们初步怀疑是采用的254nm紫外光区检测波长存在干扰,因此再次向举办方申请样品,通过实验来查找问题所在。
      由于本次实验是与检科院的能力实验样品一起做,检科院的样品过于稠厚,无法固相萃取,所以我们做了一些改变
                1根据国标采用了聚酰胺粉吸附净化洗脱
                2洗脱液由乙醇-氨水-水改成氨水-甲醇溶液
                3检测波长除254nm外,增加检测波长430nm,480nm
    实验准备
          前处理用:

                  20%柠檬酸溶,实测PH=1.38
                  甲酸-甲醇液(体积比4+6)
                  氨水-甲醇(2%):(200ml容量瓶放4ml浓氨水加甲醇定容至刻度),
                  PH=4水:100ml纯水加2滴20%的柠檬酸液,实测PH=3.30
                  PH=6水:直接用纯水,实测PH=6.02
                  聚酰胺粉,G3垂融漏斗
          流动相
                  甲醇:Amethyst  Chemicals  HPLC/ACS
                  乙酸铵溶液:0.02mol/L,0.45μm滤膜抽滤后使用
        标准品
            中国计量科学研究院购买食用合成色素柠檬黄溶液标准物质(编号GBW(E)100001a),浓度为0.500 mg/mL,食用合成色素日落黄溶液标准物质(编号      GBW(E)100003a),浓度为0.500mg/mL
        标系配制
              1预实验配制20ug/mL的标准点进样,取样品过0.45μm滤头直接进样,粗略估计样品中目标组分含量范围,确定标准曲线的范围
              2取10mL比色管5个,加入柠檬黄标准溶液各0.1,0.2, 0.4 ,0.,6, 0.8mL纯水定容至10mL,
                              标准系列溶液  柠檬黄(μg/mL)5  10 20  30  40
      仪器与设备
            戴安液相色谱(P680 HPLC)  UVD170U紫外检测器
            VIS-1: 254nm  VIS-2 : 430nm  VIS-3: 480nm
            色谱柱:安捷伦柱  5μm  4.6*250mm
    样品前处理
            1. 根据样品中色素含量的高低,在千分之一电子天平上称样5-10g于50ml玻璃离心管,记录重量,然后称重1g聚酰胺粉用5ml水混匀后加入样品管,再用5ml水洗涤后一并加入,定容到25ml,每个样品管涡旋2min,静置1小时以上,再涡旋2min(如时间紧,可涡旋一次)

               
          2.将离心管中样品振摇混匀后,倾入G3垂融漏斗,尽量搅匀,使固形物均匀下沉形成厚度一致的聚酰胺层,便于除杂洗脱
               
        3. 聚酰胺混合液在垂融漏斗中静置沉降一会后,真空抽走液体,进入洗涤程序
              A:用pH=4的水,每次10ml洗涤2次,5ml洗涤1次,可真空抽提
              B:用甲醇-甲酸溶液,每次10ml洗涤2次,5ml洗涤1次,可真空抽提
              C:用纯水洗涤,至流出液呈中性,每次10ml洗涤3次以上,可真空抽提
        4. 解吸  用2%的氨水甲醇液解吸,首次加入7ml解吸液,不要抽提,通过重力自然洗脱,收集于10ml比色管,尽量使聚酰胺层洗至无色,置氮吹仪吹净甲醇和氨,近干,加纯水定容至10ml待测

  液相色谱分析
(进样20μL)

      1 标准曲线回归方程


           

254nm

430nm

480nm

 



ŷ=14.842x+5.420

ŷ=15.208x+5.929

ŷ=3.681x+2.255

r=0.9998

r=0.9998

r=0.9999




2样品分析


柠檬黄

直接进样

聚酰胺粉净化

254nm

峰高

534.72

536.05

221.52

221.65

结果(mg/kg)

70.16

28.62

430nm

峰高

244.91

243.76

227.38

227.51

结果(mg/kg)

30.80

28.62

480nm

峰高

61.03

61.05

55.63

55.68

结果(mg/kg)

31.38

28.50


      从数据可以看出,直接进样检测,结果是偏高的,特别是254nm处,聚酰胺粉净化后进样结果都在可接受范围
      注:样品指定值    柠檬黄(mg/kg):28.3±1.41
  回收率

 

柠檬黄

 

样品

 

样品加标(10ug/ml)

 

254nm

峰高

197.28

197.58

344.36

343.36

浓度(ug/mL)

12.93

12.95

22.84

22.77

均值(ug/mL)

 

12.94

 

22.805

回收率(%)

 

98.6

 

430nm

峰高

202.56

202.78

353.61

352.36

浓度(ug/mL)

12.93

12.94

22.86

22.78

均值(ug/mL)

 

12.935

 

22.82

回收率(%)

 

98.8

 

480nm

峰高

49.49

49.73

85.83

85.64

浓度(ug/mL)

12.83

12.90

22.70

22.65

均值(ug/mL)

 

12.865

 

22.675

回收率(%)

 

98.1



结果分析
      从结果来看,采用聚酰胺粉直接净化,柠檬黄在三个波长检测的结果一致,254nm波长处并未出现我们最初怀疑的紫外区的吸收干扰,这使我们感到困惑,第一次出现的结果偏高的原因在哪?
由于此次实验和上次相比,我们改变了一些条件,为了重现上次的实验过程,我们又重新采用6ml固相萃取柱作前处理,并分别采用两种解吸液解吸,验证不同的解吸液对实验结果的影响。
结果见下表
 

 

 

柠檬黄

 

日落黄

乙醇-氨水-水

氨水-甲醇

乙醇-氨水-水

氨水-甲醇

254nm

结果(mg/kg)

37.2

39.0

93.9

96.0

430nm

结果(mg/kg)

27.9

29.2

93.9

96.1

480nm

结果(mg/kg)

28.3

29.5

95.1

97.3


      对比实验数据发现采用固相萃取柱净化,柠檬黄在254nm处的检测结果明显偏高同时实验结果显示,两种解吸液在固相萃取柱上解吸,氨水-甲醇液解吸液的结果略高于乙醇-氨水-水的萃取结果,由于数据偏少,这个结论有待于更多的实验确认。

所有数据汇总如下表

 

柠檬黄

 

聚酰胺粉净化

 

固相萃取柱萃取

 

254nm

峰高

221.52

221.65

274.27

275.36

浓度(ug/mL)

14.56

14.57

18.97

19.05

结果(mg/kg)

28.6

28.6

37.12

37.28

 

430nm

峰高

227.38

227.51

221.87

224.01

浓度(ug/mL)

14.56

14.57

14.83

14.98

结果(mg/kg)

28.6

28.6

29.0

29.3

 

480nm

峰高

55.63

55.68

54.55

55.10

浓度(ug/mL)

14.50

14.51

15.00

15.17

结果(mg/kg)

28.5

28.5

29.4

29.7


      由此可以看出我们在七月初参加的饮料中草根对比试验中,采用固相萃取柱净化,并以254nm作为检测波长,色素柠檬黄检测结果确实会偏高。这种现象是这一品牌固相萃取柱特有的现象还是共同的现象,我们又对比做了另外一品牌固相萃取柱,结果如下:
 

 

 

柠檬黄

 

固相萃取柱(品牌A)

 

固相萃取柱(品牌B)

254nm

结果(mg/kg)

37.12

37.28

38.59

38.43

430nm

结果(mg/kg)

29.02

29.32

28.85

28.85

480nm

结果(mg/kg)

29.35

29.69

29.14

29.12

    从数据可以看出,采用固相萃取柱净化,柠檬黄在254nm处的检测结果会明显偏高,对此我们怀疑是不是固相萃取柱本身会带入在紫外区254nm处有吸收的物质影响检测结果,于是加做了全程含固相萃取柱净化流程的空白实验,品牌A和品牌B固相萃取后空白液254nm吸收谱图如下:   



      由上述谱图看出两种固相萃取柱空白解吸液在254nm处柠檬黄吸收值为零,也就是固相萃取柱本身并未带入254nm处有吸收的成分,那么样品中柠檬黄采用固相萃取净化,选择254nm测试结果偏高的到底是什么原因?此次实验仍未找到结论,只是发现样品中色素柠檬黄采用固相萃取净化,在254nm处检测存在很大风险

综上所述,针对样品中色素柠檬黄的检测,:一是可采用聚酰胺粉直接净化,二是采用430nm或480nm波长作测试波长。
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石头雨
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xww428
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不知其他实验室有没有遇到类似的情况? 用固相萃取柱净化后在254nm处测柠檬黄,结果偏高的原因有没有更合理的解释?
静如
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第一时间收到检科院的反馈信息,也充分验证了此次方法整改的有效性
该帖子作者被版主 石头雨2 积分, 2经验,加分理由:鼓励
静如
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原文由 石头雨(baby073125) 发表:
整改后还需要进行验证有效性的。
是的,刚收到反馈信息,谢谢老师的建议
石头雨
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原文由 静如(v2778238) 发表:
第一时间收到检科院的反馈信息,也充分验证了此次方法整改的有效性
不错,恭喜整改成功。
wccd
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lifengsasa
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你好,我想请问一下。你的洗脱液为什么改成氨水-甲醇溶液,是洗脱能力强么?这里面主要起洗脱作用是氨水么?采用国标的乙醇-氨水-水,最后总是有颜色洗不掉,小白真心求助
我是风儿
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还是不明白造成你们第一次柠檬黄偏离的原因
静如
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原文由 lifengsasa(lifengsasa) 发表:
你好,我想请问一下。你的洗脱液为什么改成氨水-甲醇溶液,是洗脱能力强么?这里面主要起洗脱作用是氨水么?采用国标的乙醇-氨水-水,最后总是有颜色洗不掉,小白真心求助
我们做了对比,洗脱能力差不多,没有区别,我们主要考虑的因素是后期氮吹浓缩,乙醇-氨水-水中水的比例比较大,而氨水-甲醇中水含量少,缩短氮吹时间。你在洗脱的时候有没有抽,建议利用自然沉降洗脱,不要抽,这样可以充分洗脱,