主题:【第九届原创】超微结构保存更好——高压冷冻与冷冻替代样品制备技术

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qflaabbcc
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最近一直在摸索着用高压冷冻和冷冻替代样品制备技术,刚开始做的时候冰晶特别严重,如下图Hela细胞。冰晶已经把细胞超微结构破坏的不行了。

经过很长时间的摸索,得到以下制样方法:
1 取样
1.1 培养细胞:取适量的细胞悬浮液,低速离心成细胞团,去上清,细胞团呈米糊状,用移液枪取适量细胞,填满Carrier,加入适量冷冻保护液1-Hexadecene,滤纸吸取多余水分,使冷冻保护液液面略高于Carrier(Carrier用丙酮清洗,然后在空气中晾干,用1-Hexadecene浸泡备用)。
1.2 小鼠肝脏:从活体上取出的组织,先用锋利的刀片在低温下切成尽可能薄片状,从中挑选合适的部分切下来,然后装入Carrier,加入适量冷冻保护液1-Hexadecene,滤纸吸取多余水分,使冷冻保护液液面略高于Carrier。
2高压冷冻
高压冷冻仪在使用前,要先做一些准备工作:要先加入足够的液氮,并加入压力液甲基环己烷,然后用空载的carrier高压冷冻三次,保证高压冷冻仪在最佳工作状态。
2.1 将上述装有样品的carrier快速安置到高压冷冻仪,准备高压冷冻。
2.2 高压冷冻样品,迅速把样品冷冻下来,并做好记录。通过高压冷冻仪冷冻样品后产生的冷冻速度和压力变化曲线,可以选择冷冻效果较好的样品继续下面实验。
2.3 转移样品,首先把现配的替代液1%锇酸(0.5g锇酸溶于50mL丙酮)分装到2mL冻存管中,迅速放入液氮冷冻备用,冷冻过程中保持冷冻管直立。与此同时,冷冻替代仪加满液氮,将自制的冻存管架放入样品腔,预冷至-100℃。用预冷的镊子,在液氮下将Carrier分别装入冻存管,冻存管盖不宜拧的过紧,然后迅速转移到冷冻替代仪样品腔室的冻存管架里。
3 冷冻替代

步骤

温度

时间

1

            -100℃    -90℃

4h

2

-90℃

72h

3

    -90℃    -60℃

8h

4

-60℃

8h

5

    -60℃    -30℃

4h

6

-30℃

8h

7

    -30℃    -20℃

2h

8

-20℃

8h

9

    -20℃    4℃

2h

10

4℃

1h



温度达到4℃后,用4℃的丙酮浸洗样品3次,每次15分钟。此过程中,会有部分样品与Carrier分离,若还有没分离的可以用解剖针将样品从Carrier中剥离。
4 渗透包埋
分别用以下渗透液渗透。

步骤

渗透液

浓度

时间

1

Epon812/丙酮

1:1

1.5-2h

2

Epon812/丙酮

3:1

6-12h

3

Epon812

100%

1h

4

Epon812

100%

8h

5

Epon812

100%

1h


然后将样品转移至包埋槽,60℃烘箱聚合48h。
5 超薄切片
把两种生物样品对应的每一个包埋块分别超薄切片,各捞两个铜网,并染色。
6 电镜观察
观察细胞内超微结构保存情况,对感兴趣区域拍照。
终于有所改善,如下图的小鼠肝脏细胞,轮廓十分清楚,结构保存完好。

局部放大后观察,能看见核孔,双层核膜,甚至是膜的磷脂双分子层结构(这是在常规化学固定制样中很难看到的),看到这些让人激动不已。

碰巧看见一个正在分裂的线粒体。线粒体脊很清楚,双层膜紧挨着,不像常规制样间隙那么大。另外,线粒体基质保存完好,所以线粒体整体较细胞基质反差大。

以下是常规化学固定制样的结果,可与上面高压冷冻及冷冻替代制样技术结果对比:


与常规化学固定相比,高压冷冻及冷冻替代技术制样有以下优点:
1 分辨率更高。能看见细胞内各种细胞器膜的磷脂双分子层的结构,这个在常规制样中看不到。
2 结构保存更真实。线粒体的双层膜更紧凑,常规制样因抽提等影响导致双层膜间隙较大。
希望能与同行多交流高压冷冻仪和冷冻替代制样技术,大家共同进步。
该帖子作者被版主 洪星二锅头8 积分, 2经验,加分理由:感谢分享
洪星二锅头
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感谢分享,现在电镜在生物行业是相当火热,希望能见到你更多的原创帖
UNM
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谢谢分享,一直想学习生物方面的扫描电镜知识。
qflaabbcc
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笑话大仙
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